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Periodico della Società Italiana di Farmacologia - fondata nel ANNO VI n. 22 Giugno 2010 Riconosciuto con D.M. del MURST del 02/01/ Iscritta Prefettura di Milano n. 467 pag. 722 vol. 2 I glucocorticoidi
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Periodico della Società Italiana di Farmacologia - fondata nel ANNO VI n. 22 Giugno 2010 Riconosciuto con D.M. del MURST del 02/01/ Iscritta Prefettura di Milano n. 467 pag. 722 vol. 2 I glucocorticoidi nel 2010 Giuseppe Nocentini e Emira Ayroldi Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Sezione di Farmacologia Università degli Studi di Perugia I glucocorticoidi (GCs) tra fisiologia e clinica: un rapporto dialettico I glucocorticoidi giocano un ruolo importante nella terapia antinfiammatoria e immunosoppressiva. In particolare, i GCs sono ampiamente utilizzati per trattare le reazioni allergiche, le malattie infiammatorie e autoimmunitarie, quali ad esempio asma, dermatite, malattie infiammatorie intestinali, artrite reumatoide e sclerosi multipla. Inoltre, sono utilizzati nella prevenzione del rigetto dei trapianti e nel trattamento di neoplasie ematologiche. Le principali indicazioni terapeutiche dei GCs in malattie extrasurrenaliche sono riassunte nella Tabella 1. I GCs esplicano un importante azione sul sistema immunitario (fisiologica e farmacologica), modulando in modo significativo l attività di tutte le cellule che partecipano alla risposta immune (naturale e adattativa). L attività immunosoppressiva si sovrappone a quella antinfiammatoria: entrambe richiedono l attivazione del recettore dei GCs (GR) e condividono meccanismi molecolari che coinvolgono l inibizione della attività leucocitaria. D altra parte, i GCs agiscono anche sulle strutture parenchimali e connettivali proteggendole dagli effetti nocivi della risposta infiammatoria, sempre attraverso l attivazione del GR. Nella valutazione degli effetti farmacologici dei GCs, è importante sottolineare che i GCs endogeni svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella maturazione del sistema immunitario e di altri organi, come ampiamente dimostrato dai modelli animali geneticamente modificati e dagli studi sui polimorfismi del recettore dei GCs. Ambedue questi modelli hanno dimostrato a pieno la complessità della azione dei GCs su diversi organi e sistemi, al punto che polimorfismi del GR hanno ricadute su patologie psichiatriche, quali, ad esempio, la depressione [1]. La molteplicità d azione dei GCs ha un pesante rovescio della medaglia in termini di effetti danni al sistema nervoso centrale. Gli effetti avversi dei GCs (riportati in dettaglio in Tabella 2) sono in parte correlati ai loro effetti sul sistema immunitario (come, ad Tabella 1 - Indicazioni terapeutiche extrasurrenaliche dei GC Quaderni della SIF (2010) vol Tabella 2 - Principali reazioni avverse dei glucocorticoidi esempio, un ritardo nel processo di riparazione delle ferite e una aumentata suscettibilità alle infezioni), ad effetti sul metabolismo (come, ad esempio, diabete e obesità) e all aumento del catabolismo proteico (con effetti sul sistema osteoarticolare, muscolare e cutaneo). Meccanismo d azione dei GCs La maggior parte degli effetti mediati dai GCs, a concentrazioni fisiologiche e farmacologiche, dipendono dalla loro interazione con il GR. L isoforma del GR maggiormente studiata e più espressa (GRa) presenta diverse regioni, funzionalmente specifiche, attraverso le quali il GR omodimerizza, si lega al DNA o interagisce con l ormone. Nonostante si conosca un solo gene responsabile per la sintesi del GR, recenti studi hanno chiaramente dimostrato la presenza di diverse forme isomeriche del recettore dovute a modificazioni trascrizionali e post-trascrizionali. Il gene GR produce, infatti, diversi splicing, dei quali due sono maggiormente espressi: il GRa e il GRb (Figura 1a e b). Quest ultimo deriva dallo splicing alternativo dell esone 9 che comporta da una parte la perdita della capacità di legare il GC e dall altra un azione inibente il GRa attivato [2]. Un acquisizione relativamente recente è che sull esone 1 e 2 sono presenti un gran numero di ATG che permettono l inizio della traduzione della proteina [3] e che conferiscono al gene la potenzialità di sintetizzare diverse forme isomeriche del GR (GRaA, GRaB1, GRaB2, ecc.). Le diverse isoforme presenti nelle cellule sono illustrate in Figura 1c. Come è logico attendersi, questi recettori hanno diversa affinità per i GCs e sono differentemente espressi nei diversi tessuti e nelle diverse cellule, condizionando così la risposta biologica [4]. Inoltre, ciascuna di queste isoforme può andare incontro ad un diverso grado di fosforilazione, ubiquitinazione e sumolazione (Figura 1d), che modificano ulteriormente le proprietà funzionali dei GR [5, 6]. In definitiva, meccanismi trascrizionali, traduzionali e post-traduzionali producono diversi GR nei diversi tessuti e ciò può spiegare, almeno in parte, le molteplici azioni fisiologiche dei GCs ed anche come mai la risposta ai differenti i GCs possa essere diversa. I GR modulano la trascrizione genica (effetti genomici) La maggior parte dei recettori GRa (fa eccezione, ad esempio, la isoforma GRaD) è localizzata nel citoplasma complessata a proteine diverse e non tutte note (heat shock proteins, immunofilline, protein chinasi e fosfolipasi) a formare il complesso del recettosoma. Quando il GC si lega al GR, si ha un cambiamento conformazionale del GR che si dissocia dal recettosoma, migra nel nucleo, dimerizza e si lega a specifiche sequenze del DNA chiamate GRE (Glucocorticoid Responsive Elements), presenti nei promotori dei geni target dei GCs. In questo modo i GCs inducono l espressione di centinaia di geni [7-10]. È interessante notare che la regolazione positiva della sintesi proteica è più o meno intensa in funzione del tipo di isoforma che lega i GRE. Il GRaC3, per esempio, ha un attività regolatoria a livello trascrizionale 2 volte superiore a quella di GRaA. Il GRb compete Figura 1 - Struttura del gene umano che codifica per il recettore dei GCs. Gli esoni sono numerati da 1 a 9 (a) e i diversi pattern corrispondono alla funzione della sequenza amminoacidica da loro codificata, come illustrato nel panello (c). Gli introni sono in nero. Il diverso assemblamento degli esoni dà luogo a diversi splicing. I due più espressi (GRa e GRb) sono illustrati nel panello (b). La traduzione dell esone 2 per il GRa e GRb può iniziare da ATG diversi, come illustrato nel panello (c) per GRa. Nel panello (d) sono mostrati i siti sui quali il GR può essere fosforilato (P), sumolato (Su) e ubiquitinato (Ub) Quaderni della SIF (2010) vol. 22 con il GRa attivato per il legame con i GRE, ma non essendo capace di attivarlo, impedisce al GRa attivato/dimerizzato di svolgere la propria azione. Inoltre, l attività del GRa livello del GRE può essere modulata positivamente e negativamente da altri fattori. Peroxisome proliferator activated receptor-a (PPAR-a), per esempio, sinergizza con il GR, mentre l istone deacetilasi-2 (HDAC2) ne inibisce l attività trascrizionale [11, 12]. I GCs possono regolare negativamente la trascrizione genica. La presenza di GRE negativi (ngre) è stata a lungo supposta, ma mai dimostrata. Oggi si ritiene che un meccanismo più plausibile di inibizione della trascrizione genica sia la eterodimerizzazione del GR attivato con altri fattori di trascrizione che regolano positivamente la trascrizione, che sono così inibiti proprio dal legame con il GR. Questo meccanismo è stato dimostrato per numerosi fattori trascrizionali come NF-kB, AP- 1, IRF-3, STAT, CREB, NF-AT, T- Bet e GATA-3 [13]. Alcuni di essi giocano un ruolo fondamentale nella regolazione dell espressione di mediatori della risposta infiammatoria e immune. Un altro meccanismo di inibizione della trascrizione, comporta il reclutamento di co-repressori invece di co-attivatori. Ad esempio, quando HDAC2 è reclutato dal GR al sito di legame con il GRE, ne inibisce l attività trascrizionale. Infine, l inibizione della trascrizione mediata dai GCs è anche secondaria all over-espressione, GREdipendente, di inibitori di fattori di trascrizione pro-infiammatori. Ad esempio, i GCs aumentano l espressione di I-kB e di GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucin Zipper), quest ultimo clonato più di 10 anni fa nel nostro laboratorio, che legano e inibiscono NFkB [14-16]. In definitiva, la regolazione trascrizionale positiva e negativa mediata dai GCs (effetti genomici) dipende anche dall espressione da parte della cellula di fattori di trascrizione e ciò determina effetti diversi nelle diverse cellule. Gli effetti dei GCs sulle diverse cellule sono differenti: possibile correlazione con la variabilità individuale della risposta clinica dei pazienti L osservazione che i GCs danno effetti diversi in tessuti diversi non è solo clinica. Negli ultimi 10 anni sono stati effettuati studi in vitro di microarray su diverse cellule trattate con GCs per scoprire se i geni modulati dai GCs fossero gli stessi nei diversi tessuti [7-9]. In uno studio di meta-analisi, che analizzava i geni responsabili dell apoptosi indotta dai GCs nelle cellule T, a diverso grado di maturazione, normali e neoplastiche, è stato sottolineato che solo pochi geni compaiono in tre o più studi [17]. Ciò porta alla conclusione che i diversi meccanismi descritti nei paragrafi precedenti operano al fine di diversificare la risposta genica nelle diverse cellule. Tra i geni invariabilmente modulati dai GCs si annovera GILZ, che può essere considerato un marker universale di risposta ai GCs [18]. La diversa risposta ai GCs (apoptosi, differenziazione, inibizione della proliferazione, ad esempio) non dipende solo dalla modulazione di geni diversi ma anche dallo stato funzionale della cellula. Per esempio, i GCs regolano l apoptosi, inducendola o inibendola, e questo è possibile perché l induzione dell espressione dei geni pro-apoptotici induce apoptosi solo in specifiche popolazioni cellulari, in rapporto allo stato funzionale/differenziativo. A questo proposito, il nostro gruppo ha dimostrato che nei timociti che vanno incontro ad apoptosi in seguito al trattamento con GCs, non c è solo l induzione di geni pro-apoptotici o la down-regolazione di fattori anti-apoptotici, come ci si potrebbe attendere, ma anche la up-regolazione di un gran numero di geni anti-apoptotici (quali, ad esempio, il recettore per la interleuchina (IL)-7 o CTLA-4 [7], che, in questo caso specifico, non è sufficiente per dare una risposta protettiva, ma che in altri contesti biologici potrebbe darla). È nostra opinione, infatti, che un simile ragionamento possa essere applicato non solo a tessuti differenti, ma anche a sottopopolazioni cellulari differenti (come quelle linfocitarie e macrofagiche), nelle quali, infatti, i GCs inducono effetti diversi quali apoptosi, proliferazione o differenziazione. Polimorfismi del GR, diversa localizzazione delle isoforme nelle cellule e nei tessuti e variabilità della risposta ai GCs in funzione di eventuali costimoli ambientali, sono certamente alla base della differente risposta clinica individuale allo stesso farmaco. Gli effetti non-genomici dei GCs Qualche anno fa, un medico di Medicina Generale ci riferiva con ammirazione degli effetti miracolosi dei GCs somministrati per via endovenosa su un suo paziente in shock. In questi casi quello che colpisce è, innanzitutto, la velocità con cui il paziente risponde. Anche l effetto della somministrazione topica dei GCs durante un attacco d asma si manifesta rapidamente. Per quanto alcuni degli effetti genomici dei GCs possano iniziare dopo 10 minuti dal contatto del GC con la cellula, gli effetti sopra descritti sono difficilmente attribuibili alla modulazione della trascrizione genica. Infatti, una serie di effetti non-genomici, più veloci, sono responsabili della risposta clinica quasi immediata. L attivazione di secondi messaggeri, l innesco di numerose cascate di trasduzione Quaderni della SIF (2010) vol del segnale, come ad esempio, l attivazione della fosfolipasi, la modulazione del camp e dei pathways delle proteine chinasi e la mobilizzazione del Ca ++ sono stati di volta in volta chiamati in causa per spiegare gli effetti rapidi dei GCs [19-21]. Si suppone che gli effetti non-genomici dipendano dall attivazione del GR e del recettosoma, ma anche dalla modulazione di recettori transmembrana non specifici per i GCs (come, ad esempio, il GABA A ) e, ad alte dosi, dalla modificazione della fluidità della membrana cellulare [21]. Molti ricercatori hanno insistentemente proposto che gli effetti non-genomici dei GCs siano anche determinati da un recettore di membrana specifico per i GCs [20]. Tale recettore non è stato finora clonato e noi, d altra parte, pensiamo che i meccanismi sopra esposti spieghino a sufficienza gli effetti non-genomici dei GCs. Gli effetti non-genomici non sono solo responsabili degli effetti farmacologici dei GCs a manifestazione rapida. Essi, infatti, sinergizzano con gli effetti genomici nell ottenere gli effetti finali dei GCs. Ad esempio, il nostro gruppo ha dimostrato che i GCs inducono apoptosi dei timociti attraverso meccanismi non-genomici che coinvolgono il pathway dalla ceramide e che la stessa via di trasduzione è modulata anche da meccanismi genomici [7, 19, 22]. Effetti dei GCs sulla risposta infiammatoria/immunitaria Attraverso i meccanismi molecolari sopra descritti, i GCs giocano un ruolo fondamentale nella regolazione fisiologica dello sviluppo della risposta immune e nella soppressione della risposta infiammatoria. Gli effetti antinfiammatori e immunosoppressivi dei GCs sono inestricabilmente connessi, condividendo molti meccanismi e pathways. La 38 - Quaderni della SIF (2010) vol. 22 trans-repressione dei geni dell infiammazione è il meccanismo generalmente accettato alla base della loro risposta antinfiammatoria. I GCs inibiscono, per esempio, fattori vasoattivi e chemiotattici, enzimi lipolitici, proteolitici, proinfiammatori come ciclo-ossigenasi (COX)-2 e nitric oxide synthase type 2 (NOS2) e diminuiscono l extravasazione leucocitaria e la fibrosi. Inoltre, i GCs proteggono dall apoptosi anche il tessuto in cui l infiammazione si sviluppa con un azione anti-apoptotica diretta e con una indirettamente mediata dall inibizione dei mediatori dell infiammazione, capaci essi stessi di indurre apoptosi. Questo meccanismo è di fondamentale importanza quando coinvolge i neuroni [23]. In maniera simile, i GCs inibiscono la produzione di mediatori importanti per la generazione di una risposta immune regolando citochine, recettori per citochine, apoptosi e proliferazione in una complessa rete di segnali che coinvolge tutte le cellule della risposta immune [24]. GCs ed estravasazione leucocitaria I GCs modulano negativamente l infiammazione acuta e cronica alterando il reclutamento, l attivazione, la differenziazione e l apoptosi delle cellule del sistema immunitario innato ed adattativo. I primi stadi dell infiammazione sono caratterizzati dalla migrazione nel focolaio infiammatorio di neutrofili prima, e di monociti dopo, che differenziano in macrofagi. Nella fase che precede il reclutamento linfo-monocitario, l interazione tra le cellule endoteliali e quelle leucocitarie promuove l up-regolazione di molecole di adesione (P-selettina, E-selettina, ICAM-1 e VCAM-1)[25]. I GCs riducono la migrazione dei leucociti nel focolaio di infiammazione attraverso un meccanismo indiretto e uno diretto. Il primo riguarda l apoptosi dei leucociti e l inibizione della produzione di citochine, riducendo così l up-regolazione delle molecole di adesione endoteliali. Il secondo meccanismo riguarda invece la riduzione dell espressione di molecole di adesione, come alcune selettine ed ICAM-1 [26-28]. Inoltre, gli eventi non-genomici indotti dai GCs inibiscono i pathways coinvolti nella trascrizione di adesine e nella riorganizzazione del citoscheletro, componenti essenziali per l adesione e la mobilità cellulare [29]. GCs e macrofagi I macrofagi sono la componente chiave nelle prime fasi e nella progressione dell infiammazione, ma oggi è noto che partecipano anche nelle fasi risolutive grazie alla loro plasticità funzionale. Inoltre presentano l antigene alle cellule T e possono essere polarizzati, in base agli stimoli ambientali a cui sono sottoposti, in M1 e M2. I macrofagi M1 (indotti da IFN-g, LPS, TNF, GM-CSF) producono citochine pro-infiammatorie (IL-1b, TNF-a, IL-6) e inducono risposte polarizzate Th1, mentre i macrofagi M2 sono dotati di funzioni immuno-regolatorie, promuovono rimodellamento e riparazione cellulare e inducono prevalentemente risposte polarizzate Th2. I GCs interferiscono con la funzione macrofagica attraverso molti meccanismi. Diminuiscono, per esempio, la loro capacità di presentare l antigene e l azione facilitante che ha l IFN-g sulla loro capacità di processare l antigene [30]. Il trattamento dei macrofagi con GCs induce una sottopopolazione macrofagica M2 e down-regola le citochine pro-infiammatorie come il TNF-a [31, 32], che gioca un ruolo chiave nella patogenesi di malattie autoimmunitarie e infiammatorie. Inoltre i GCs down-regolano nei macrofagi l espressione di molecole costimolatorie e dell HLA (human lymphocyte antigen), il rilascio di citochine (IL-1, IL-6, IL12p70) e chemochine come Rantes e macrophage-inflammatory-protein (MIP)-1a [33]. I GCs inducono anche apoptosi dei monociti umani di sangue periferico attraverso l up-regolazione del recettore apoptotico Fas e del suo ligando- Fas-L [34]. GCs e linfociti L azione immunosoppressiva dei GCs, che si osserva in seguito al trattamento delle malattie autoimmunitarie e nella infiammazione cronica, dipende soprattutto dalla modulazione della risposta immunitaria adattativa con particolare riferimento all attivazione dei linfociti T. I GCs hanno un azione pro-apoptotica sui timociti doppio positivi CD4 + CD8 + [7, 35], controllando in questa maniera la selezione timica, come suggerito dai modelli dei topi difettivi per l espressione/funzione del GR [36]. Inoltre, i GCs modulano la differenziazione dei linfociti T maturi controllando l espressione di citochine e dei loro recettori. I GCs, ad esempio, down-regolano l IL-2, cruciale per l attivazione ed espansione dei linfociti T [37], inibiscono la produzione di IFN-g inibendo lo sviluppo di una risposta Th-1, mentre up-regolano la produzione di IL-4 favorendo una risposta Th-2. Anche molti recettori come IL-7R e Notch1 e alcuni fattori di trascrizione come GILZ e Runx1, sono regolati dai GCs e sono al contempo cruciali nella differenziazione delle cellule T [7, 15, 38-40]. Le cellule T regolatorie (Treg) sono una sottopopolazione di linfociti T CD4 + CD25 + o CD8 + CD25 + capaci di inibire l eccessivo sviluppo di una risposta immunitaria e di prevenire risposte immunitarie inappropriate contro antigeni self o antigeni non-self innocui [41, 42]. Le Treg giocano un ruolo chiave nel mantenere la tolleranza periferica, controllando quella piccola parte di cellule T circolanti autoreattive che evadono dalla selezione timica. Studi recenti dimostrano che i GCs favoriscono l espansione di sottopopolazioni di T regolatorie a fenotipo CD8 + CD28 - e FoxP3 + CD4 + CD25 + [43] e promuovono la sintesi di citochine antinfiammatorie come l IL-10 [44]. Infine, le Treg dimostrano una sensibilità diversa nei confronti dell apoptosi indotta dai GCs rispetto ai linfociti effettori CD4 + CD25 - [45]. GCs e cellule dendritiche Le cellule dendritiche (DC) rappresentano il principale sistema di connessione tra l immunità innata e quella adattativa. Grazie alla loro plasticità funzionale, sono in grado di stimolare le cellule T potentemente o debolmente a seconda del loro grado di maturazione. È dimostrato che mentre le DC mature promuovono l attivazione dei linfociti T naïve, quelle immature sono tollerogeniche, inducendo anergia ed apoptosi delle cellule T [46, 47]. Numerosi modelli sperimentali in vitro suggeriscono effetti diversi dei GCs sulle DC. I GCs, infatti, attraverso l induzione della sintesi di IL- 10 o l inibizione della sintesi di IL-12 hanno effetti tollerogenici sulle DC di derivazione midollare (BMDC), su linee cellulari murine e sulle cellule dendritiche umane derivanti
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